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体外建立气管上皮模型,对新冠病毒的研究至关重要!
发布日期:2020-06-05 | 点击次数:361

2020新年伊始,新型冠状病毒肆虐,肺炎疫情形势严峻。大量的医务工作者日以继夜地奋战在第一线,科研人员也争分夺秒地进行着抗击病毒的研究。康宁生命科学建立了体外气管模型——气-液界面支气管上皮模型,助力新型冠状病毒分离培养和致病机制研究。




病毒是如何入侵到体内的?



气管上皮是呼吸道防御系统的重要屏障,也是新型冠状病毒和其他有害病菌侵染人体的第一个突破口


新型冠状病毒感染时,通过鼻腔和口腔进入到人体咽喉部,进一步蔓延到气管及支气管。气管、支气管、细支气管等表面的纤毛细胞含有细长的刷子状的纤毛,表面的杯状细胞还能够分泌粘液,粘液包裹病毒,并依靠纤毛向上的推动,将粘液经气腔道从口内排出,即咳痰

当病毒突破气管/支气管的防线,入侵肺泡后,肺泡部位由于缺乏纤毛以及杯状细胞,难以通将分泌物和组织细胞碎片排出至体外,从而产生干咳症状和胸闷的感觉,并进一步形成肺部组织感染。


在如今形势下,建立起体外气管模型,模拟气管上皮屏障,进行新型冠状病毒的研究,显得尤为重要。



如何在体外建立支气管上皮模型?   



气液界面(Air-liquid interface,ALI)模型是呼吸道研究的重要模型。该模型培养的细胞在功能和结构上贴近体内气管上皮细胞的自然生长环境和状态,为研究气管上皮的功能和相关疾病奠定了良好的基础。该模型被广泛应用于多种呼吸道病毒的分离培养及致病机制研究,特别是一些普通培养的细胞上难以增殖的病毒,如冠状病毒、博卡病毒等。


支气管上皮气-液界面模型的应用:

•      经呼吸道的病毒培养分离、致病机制研究

•      经支气管/肺部的药物转运、作用机理研究

•      空气污染物的毒性研究,如PM2.5等

 

康宁生命科学在Transwell上成功建立了支气管上皮气-液界面模型,培养出假复层纤毛柱状上皮,观察到纤毛,并检测到粘液和囊泡。

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建立模型方法


1. 接种Calu-3细胞到Transwell小室(Corning #3470,24孔,0.4µm PET膜)中。上室培养基150μl,下室培养基800μl。培养过夜。

注:Calu-3为上皮细胞样的人肺腺癌细胞。也可采用原代支气管上皮细胞或其他气道上皮细胞。

注:康宁旗下Corning品牌Transwell和Falcon品牌小室,0.4µm PC膜、PET膜,均可用于本实验。

2. 将气-液模型的Transwell上室中的培养基去除,下室更换为500μl培养基。液-液模型换液,上下室均加入培养基。

3. 每隔2-3天换液,培养3周。中间监测跨膜电阻(TEER)值,并观察细胞形态。

4. 荧光黄渗透实验检测上皮细胞层的完整性。切片、包埋、染色,检测柱状上皮形态和分泌物。

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图1:支气管上皮气-液界面模型的建立流程




结果


1. 跨膜电阻TEER值和荧光黄渗透实验结果表明,经21天培养后,形成了融合的、致密的上皮细胞层。(体现气管上皮屏障的完整性)

2. 培养3周后,气-液模型形成假复层柱状上皮,并能观察到纤毛。液-液模型形成简单的立方上皮。如图所示。

3. 在气-液界面培养3周的细胞中可见粘液分泌物和囊泡。如图所示。

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图2:HE染色显示,培养3周后,气-液模型形成假复层柱状上皮,并能观察到纤毛。液-液模型形成简单的立方上皮。

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图3:气-液界面培养3周后可见粘液分泌物和囊泡。左图为PAS(Periodic Acid–Schiff)染色中性蛋白聚糖(红色),细胞核用核固红染色。右图为AB(Alcian blue)染色酸性蛋白聚糖(蓝色)。



该模型在功能和结构上很好地模拟了体内气管上皮细胞的生长环境和状态,为新型冠状病毒的体外培养分离和研究提供了平台,并可用于其他支气管/肺部相关的疾病研究和药物筛选。


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